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摘要

抗微生物药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）对全球公共卫生构成重大威胁。移动微生物学实验室能够在地理偏远和资源有限的地区（如加拉帕戈斯群岛）开展 AMR 环境监测。本研究报道了一种用于在圣克里斯托瓦尔岛（San Cristóbal）周边海域开展 AMR 监测的移动实验室的开发与应用，该岛是加拉帕戈斯群岛中人口第二多的岛屿，近年来经历了快速城市化和高强度国际旅游压力。对受污水污染的海洋站点开展的现场宏基因组测序显示，与非污染海洋站点相比，微生物属组成发生显著改变，且 AMR 基因数量更高，其模式与当地未经处理的生活污水的宏基因组结果相吻合。在污水排放口附近的污水或海洋环境中直接分离的乳糖发酵肠杆菌科（lactose-fermenting Enterobacteriaceae）分离株中，超过 40% 表现出多重耐药（multidrug resistance, MDR）表型。对 MDR 大肠杆菌（Escherichia coli）开展长读长测序并进行质粒从头组装表明，AMR 基因在质粒上频繁且快速地重排，从而在岛上产生多样化且具有功能的耐药组（resistome）。本研究不仅为在资源有限环境下开展 AMR 研究提供了框架，也凸显了污水污染对环境 AMR 格局的影响，并提示了对人类和动物健康的潜在威胁。

Keywords：抗微生物药物耐药性；加拉帕戈斯群岛；移动实验室；污水污染；宏基因组学；长读长测序；质粒重排；大肠杆菌；One Health

文献信息

• Lal, A., Riopelle, J. C., Villarin, K., Mathur, M., Enriquez, L., Xiao, R., Phemister-Jimenez, N., Gilbert, K., Cole, S. D., Tilyou, M., Kennedy, K. P., Vaca, E., Castillo, W., Weisberg, M., Mattei, L. M., & Beiting, D. P. (2026). Human wastewater contamination drives the emergence of multidrug-resistant bacteria in the Galápagos marine ecosystem.Nature Communications, 17, 7601. https://doi.org/10.1038/s41467-026-74899-9
• 期刊：Nature Communications（IF = 18.1）
• 在线发表：2026 年 8 月 4 日

研究总结

背景介绍

AMR 已被列为全球公共卫生的重大威胁，2021 年细菌耐药性关联死亡约 500 万例，占全球死亡总数的 9%，预计到 2050 年负担将翻倍。在低收入和中等收入国家（LMICs），由于监测与废物管理基础设施不足、疫苗接种率低、城市化快速推进以及抗菌药物滥用等因素，AMR 的影响尤为严重。

加拉帕戈斯群岛是研究人类活动如何影响海洋生态系统 AMR 涌现与演化的天然实验室。圣克里斯托瓦尔岛是群岛中唯一拥有功能性污水处理厂（wastewater treatment plant, WWTP）的岛屿，该系统建于 1982 年，约 2012 年全面运行，采用合流式溢流（combined sewer overflow）设计，依靠三个泵站将海平面高度的居民区_raw sewage_ 抽升至高处的 WWTP。然而，随着岛上人口过去数十年增长四倍，系统长期超负荷并频发机械故障。2019 年 8 月至 2020 年 12 月间，WWTP 故障导致超 60 万立方米未处理污水排入周边海岸水体。2020 年的研究显示，尽管该 WWTP 对氨氮、磷酸盐等污染物的去除达到厄瓜多尔排放标准，但对总大肠菌群和大肠杆菌（E. coli）无任何去除效果，出水大肠杆菌计数超标 25 倍。

尽管存在这些特殊情况，未处理污水污染对加拉帕戈斯海洋环境的影响仍知之甚少。本研究旨在开发一种移动微生物学实验室，以识别未处理污水污染位点，并将细菌分类群、AMR 基因与耐药表型联系起来，从而在资源有限的环境下开展多模态 AMR 监测。

重要结果

结果1：持续污水污染位点的识别

作者开发并优化了一套移动微生物学野外实验室，可在无可靠冷链和连续供电的条件下运行。通过对 16 个海洋站点、2 个淡水站点和 2 个市政污水处理系统站位为期两年的采样，结合现场冻干三重 qPCR 检测通用粪便标记（Enterococcus faecalis）与人源特异性标记（HF183，来源于 Bacteroides dorei 16S rRNA），作者明确了人类粪便污染的空间与时间分布。

Figure 1 图注：移动 AMR 发现平台。无菌袋采集的海水样本通过三个工作流之一进行处理，每个工作流均强调现场适用检测与便携式设备：A 用于检测人类粪便污染的 qPCR；B 对海洋生态系统或市政排污系统中的乳糖发酵肠杆菌科分离株进行 AMR 分析；C 对海水、污水或大肠杆菌分离株进行长读长测序。工作流 A-C 的耗材与设备及其费用详见补充数据 1。图使用矢量图形编辑器 Sketch 创建。

Figure 2 图注：B 散点图，点的大小表示两年期间采集的样本数量，颜色表示人源粪便 qPCR 检测的相对荧光单位（RFU）；C 点阵图显示 13 个站点在两年的时间里的 qPCR 检测结果，每个点代表一次采样事件。地图使用 ArcGIS 软件与 Esri Outdoor 底图创建。

最强的 qPCR 信号出现在 Punta Carola Pipe 站点——该处名义上是处理污水排放口，但已被证实也是未处理污水的排放点。Playa de Oro、Muelle de Pespadores 和 Laguna 等靠近泵站与溢流口的站点亦呈现高水平人源粪便信号，且信号强度随季节与年份波动。进一步使用 MC-Media Pad 干式培养系统计数活菌，证实这些位点存在 >3000 CFU/mL 的大肠杆菌与大肠菌群，表明 qPCR 阳性位点同时存在具有活性的粪便指示菌。

结果2：宏基因组测序鉴定人源粪便污染物

为揭示污水污染对海洋微生物多样性的广泛影响并详细检视微生物基因（如 AMR 基因），作者对 2022 年与 2023 年夏季采集的 10 个样本进行了长读长宏基因组分析，同时对市政合流污水溢流系统中的 2 个未处理污水样本直接采样。纳米孔测序平均每个样本产生 4.42×10⁶ 条 reads，平均读长 1460 bp（N50 中位数 6197 bp），平均产出 12×10⁹ bp。

基于属水平分类丰度的聚类分析将站点划分为两大群组。第一组包括相对偏远的 Playa Baquerizo、无人岛 Española、市内常用海滩 Playa Mann 以及 2023 年的 Muelle de Pescadores 样本，其优势类群为海洋典型类群（聚球藻 Synechococcus、原绿球藻 Prochlorococcus、硅藻 Chaetoceros、海洋异养菌 Planktomarina、Pseudoalteromonas、Alteromonas、弧菌 Vibrio 等），肠道微生物极少，表明这些站点基本未受未处理污水影响。值得注意的是，位于市中心的 Playa Mann 分类学轮廓与偏远站点相似，说明单纯的人类游憩活动不足以构成粪便污染来源。

第二组则由污水关联站点主导，包括两个污水样本、靠近未处理污水排放口的 Punta Carola Pipe 与 Laguna，以及 2022 年的 Muelle de Pespadores 样本。这些位点的优势类群为肠道来源属（弓形菌 Arcobacter、拟杆菌 Bacteroides、双歧杆菌 Bifidobacterium、梭菌 Clostridium、大肠杆菌 Escherichia、链球菌 Streptococcus）及环境菌（假单胞菌 Pseudomonas、不动杆菌 Acinetobacter）。海洋排放口附近海水与市政污水系统在分类学轮廓上的相似性，连同 qPCR 与 CFU 结果，有力支持了这些位点受到未处理污水污染的论断。

Figure 3 图注：A 基于属水平分类丰度（顶部树状图）与 AMR 基因（底部树状图）的层次聚类热图。在 >500 bp 的重叠群中使用 AMRFinderPlus 检测的 AMR 基因。列通过 Jaccard 距离的加权平均连锁层次聚类进行聚类。左侧与下方的颜色分别表示 AMR 基因类别和采样站点类别。C 显示总 AMR 基因密度，D 按 AMR 基因耐药类别分列的 AMR 密度，以每 10 Mb 组装重叠群长度中的 AMR 基因数表示。

结果3：污水关联位点检测到多样化的耐药组

作者在长读长宏基因组数据中检测到跨越 9 个抗菌药物大类的 94 个耐药基因。AMR 基因密度最高的为污水样本重叠群，其次为 Punta Carola 排放口位点，而其他位点则含极少或无 AMR 基因。按耐药类别分列的 AMR 基因密度分析揭示了 Punta Carola Pipe 与两个污水位点之间的高度相似性，包括四环素类、β-内酰胺类和大环内酯类等耐药基因的较强存在。2022 年 Muelle de Pespadores 样本（而非 2023 年样本）与 Laguna 样本也观察到同类别但水平较低的 AMR 基因。这些数据提示，受污水污染影响的位点可能也是环境中 AMR 的来源。

结果4：环境大肠菌群的 AMR 表型分析

鉴于宏基因组中 AMR 基因的存在并不一定反映实际的耐药能力，作者进一步对从岛周海洋生态系统中回收的细菌进行 AMR 表型测定。研究聚焦于乳糖发酵肠杆菌科（主要为大肠杆菌），因其易于从 MC-Media Pad 上传代培养，且是潜在的人畜病原体。作者从淡水、海水、排放口位点或未处理污水中累计培养了 183 株乳糖发酵肠杆菌科分离株，并使用 Kirby-Bauer 纸片扩散法针对 12 种临床相关抗生素进行耐药评估。

Figure 4 图注：A 市政污水与疑似或未处理污水排放口附近的海洋站点之间，针对每种抗生素的耐药分离株比例。抗生素类别缩写为：AMC 阿莫西林/克拉维酸，AMP 氨苄青霉素，AZM 阿奇霉素，C 氯霉素，CIP 环丙沙星，CN 庆大霉素，CRO 头孢曲松，FOX 头孢西丁，MEM 美罗培南，S 链霉素，SXT 甲氧苄啶-磺胺甲噁唑，TE 四环素。B 堆叠条形图（上）与 “Upset” 图（下）显示不同抗生素耐药组合的分离株数量与站点类别。星号表示符合 MDR 标准的 AMR 组合。

在非污水位点回收的分离株中仅观察到 3 株满足 MDR 定义（即对三类及以上不同类别抗生素耐药）。相比之下，污水排放口附近的海洋站点分离株中有 26/68 株（38.2%）为 MDR，污水样本中 35/84 株（41.7%）为 MDR。64 株 MDR 分离株共呈现出 50 种独特的耐药谱。除氨苄青霉素与四环素耐药见于大多数 MDR 分离株外，大量独特的 MDR 组合暗示了无法仅用少数独立耐药谱系传播来解释的遗传多样性。部分污水与排放口分离株对六类及以上抗生素呈现表型耐药。此外，作者观察到 3 株携带对美罗培南（meropenem）表型耐药的独特菌株——鉴于世界卫生组织（WHO）已将碳青霉烯类耐药肠杆菌（包括大肠杆菌）列为重点优先级细菌病原体，这一发现尤为值得关注。

结果5：抗微生物耐药大肠杆菌的系统基因组分析

为探索岛周污水、排放口及（在较小程度上）海水中 MDR 的基因组基础，作者选取了 183 株乳糖发酵肠杆菌科分离株中具有 AMR 表型的 53 株进行长读长测序，主要关注 MDR 分离株。经过滤低质量组装后，45 个高质量组装均产生了完整的无间隙细菌基因组，其中 37 个至少包含一个完整质粒。

基于 Clermont 分型与多位点序列分型（multi-locus sequence typing, MLST）的分析鉴定出 5 个不同的系统发育组：A 组（21 株，人畜共生）、B1 组（15 株，环境与动物相关）、B2 组（1 株，高毒力人源相关）、D 组（5 株，更强毒力的肠外病原体）、E 组（2 株，与 D 组相关，与食源性暴发相关）以及 G 组（1 株）。值得注意的是，分析发现了若干全球分布的、与 MDR 相关的高风险大流行克隆，包括 ST10、ST58、ST69 和 ST155。

Figure 5 图注：45 株大肠杆菌分离株的染色体与质粒图谱。左侧为基于单拷贝基因构建的系统发育树，Clermont 分型与 ST 序列型标注于旁。中间为组装的染色体与质粒图谱，按大小降序排列。右侧热图显示各分离株的 AMR 基因检测结果（深色热图）。顶部星号表示主要在基因组中观察到的 AMR 基因。顶部带圈叉号表示带有定点突变的 AMR 基因。左侧红色标识符表示 D 组 MDR 大肠杆菌克隆，详见图 6。

染色体上几乎普遍存在多重耐药外排基因与喹诺酮耐药基因（如 acr(E/F/S)、mdt(E/F/H/M/N/O/P)、emr(E/R)、evg(A/S)），而氨基糖苷类、四环素类、磺胺类或大环内酯类的 AMR 基因几乎完全定位于质粒。这一发现凸显了长读长测序与质粒从头组装在 AMR 基因发现中的重要性。一组系统发育相关的 D 组 MDR 分离株（PCP07014、SW070912、SW070910、SW071620 和 PCP06238）尤其引人担忧——其中三株经 MLST 分析归属于 ST69 复合群，这是与肠外感染（包括尿路感染）相关的全球大流行大肠杆菌谱系。所有 D 组分离株均来自污水或在 Punta Carola 排放口附近的海洋环境中分离获得，且均在相同的三周时间内分离，从而直接将污水污染与海洋环境中 MDR 的涌现联系起来。

结果6：D 组大肠杆菌的菌株水平分析

鉴于 D 组分离株的致病潜力与巨大 AMR 负担，作者针对 SW070912、SW070910、SW071620、PCP07014 和 PCP06238 开展了泛基因组分析。五株菌的泛基因组由 3483 个核心基因簇与 1354 个附属基因簇组成，任意两株菌的核心基因组 SNP 差异不超过 300 个。从同一市政污水系统中相隔一周分离的两株 MDR 菌株 SW070910 与 SW071620 享有近乎相同的核心与附属基因组（前者仅相差 150 个 SNP），全基因组比对显示二者共线性良好，除 SW070910 中一段 469 Kb 区域相对 SW071620 发生倒位外。

Figure 6 图注：A 五株 D 组 MDR 大肠杆菌的泛基因组分析，核心基因簇与附属基因簇分别展示。B SW070910 与 SW071620 的质粒图谱，质粒按大小降序标注（P1=最大）。C SW071620 的 P4 与 SW070910 的 P2 等质粒的同线性比较，可见 SW071620 的 P1 与 SW070910 超过 200 Kb 的接合 mega-质粒 P1 完全同线，SW071620 的 P3 与 SW070910 P1 部分同线，提示质粒正在发生融合或裂变。D SW070910 的 P1 质粒与 SW071620 的 P1、P3 质粒的相关性热图，热图颜色强度反映 Jaccard 相似指数，注释显示 AMR 基因定位于质粒中保守性有限或较差的区域。

两株菌的质粒内容比较揭示了显著的质粒"洗牌"现象：SW070910 与 SW071620 分别产生 4 个和 5 个全长质粒。接合性质粒 SW071620 的 P4 与 SW070910 的 P2 长度相近且高度同线；可 mobilizable 质粒 SW071620 的 P1 在其 107 Kb 全长上与 SW070910 超过 200 Kb 的接合 mega-质粒 P1 完全同线；SW071620 的接合性质粒 P3 则与 SW070910 P1 在约 50 Kb 长度上同线。这些结果表明，这些质粒在不同细菌菌株中可能正在经历融合与/或裂变，从而导致株内质粒异质性。

为进一步评估质粒洗牌对 AMR 基因多样性的贡献，作者将 mega-质粒与两个较小的同线性质粒与涵盖 40,757 个全球分布质粒的数据库进行 BLAST 比对，并构建相关性矩阵热图。分析显示，除少数小区室外，SW071620 P3 质粒四分之三的连续区域在数据库中可被观察到，代表了无 AMR 基因的稳定的质粒"骨架"；SW071620 P1 包含一段约 20 Kb 的保守插入，AMR 基因定位于保守性极小的区域，提示这些基因为近期获得；而在 mega-质粒中，AMR 基因落于既不与质粒通用骨架也不与其他携带 AMR 基因区域相关联的区段。这表明导致 MDR 的 AMR 基因组合是在质粒中新近形成的，并未与完全保守的基因盒或稳定质粒骨架谱系相耦合。由于携带这些质粒的细菌从可通达海洋环境的市政污水中分离获得，这些质粒有可能导致对抗生素治疗无效的致病性大肠杆菌感染，从而对动物或人类健康造成显著的发病与死亡风险。

方法学参考

本研究的方法学体系可概括为以下现场多模态工作流，相关标准操作流程（SOP）已在 https://protocols.hostmicrobe.org/field-amr-sops 公开。

可供同行借鉴的关键技术要点包括：

• 免冷链 DNA 提取：使用 Biomeme M1 预填充试剂 cartridge 与注射器式提取柱，无需移液器与离心机
• 冻干 qPCR 反应：Biomeme BioPoo Enterococcus Panel Go-Strips 三重探针 qPCR，智能手机控制便携热循环仪
• 干式培养系统：MC-Media Pad 替代传统琼脂平板，无需培养基制备
• 长读长宏基因组：纳米孔 MinION 配合 Flye 元组装、proovframe 移码校正、AMRFinderPlus 耐药基因预测
• 菌株级质粒解析：Autocycler 整合 flye/miniasm/raven 多汇编器输出，实现无间隙基因组与完整质粒组装
• 全球质粒库比对：将组装质粒与 40,757 个全球质粒数据库进行 BLAST，以 Jaccard 相似指数可视化质粒骨架保守性与 AMR 基因插入 novelty

总结

本研究针对圣克里斯托瓦尔岛污水处理厂长期超负荷运行、频繁将未处理污水排入 Puerto Baquerizo Moreno 周边海域的现实问题，开发了一套多模态移动微生物学实验室。通过现场 qPCR 定位人类粪便污染热点，结合长读长宏基因组测序与分离株表型/基因型分析，研究取得以下核心结论：

第一，污水排放口附近的海洋微生物群落发生根本性转变，其分类学轮廓与市政未处理污水高度相似，且 AMR 基因密度显著高于非污染海洋站点，跨 9 个抗菌药物大类共检测到 94 个耐药基因。

第二，在污水与排放口附近的乳糖发酵肠杆菌科分离株中，MDR 比例超过 40%（污水 41.7%，排放口附近海洋 38.2%），远高于非污染位点（仅 3 株 MDR）。64 株 MDR 分离株呈现出 50 种独特耐药谱，并检出 3 株对"最后防线"抗生素美罗培南耐药的分离株。

第三，系统基因组分析揭示，MDR 表型的多样性主要由质粒而非染色体驱动——氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、大环内酯类等 AMR 基因几乎完全定位于质粒。对 D 组 MDR 大肠杆菌的深入分析表明，AMR 基因在质粒骨架上频繁发生重排与重组，形成并非由完全保守基因盒或稳定质粒谱系承载的新型 MDR 组合。这种基于质粒的快速"洗牌"机制，解释了加拉帕戈斯岛 MDR 表型的高度动态性与新颖性。

第四，研究发现的 ST10、ST58、ST69、ST155 等均是全球分布的高风险大流行克隆，其中 ST69 复合群与肠外感染密切相关。所有 D 组 MDR 分离株均在相同三周时间内从污水或 Punta Carola 排放口附近海洋环境中分离获得，直接将污水污染与海洋 MDR 涌现联系起来。

本研究不仅为资源有限环境下的 AMR 监测提供了可复制的范式——便携式智能手机驱动 qPCR、即用型冻干 qPCR 反应、MC-Media Pad 细菌分离等技术消除了耗时且易出错的操作步骤，降低了对熟练技术人员的依赖，为当地利益相关方参与监测工作打开了大门；同时也强调了将 AMR 视为 One Health 挑战的重要性。圣克里斯托瓦尔岛周边海域栖息着群岛中浓度最高的加拉帕戈斯海狮（Zalophus wollebaeki）种群，人类与海狮的密切互动为 MDR 大肠杆菌在海洋哺乳动物中的定植与扩散提供了途径，可能对这一濒危物种的健康构成威胁。

研究指出，遏制 AMR 跨生态系统传播对 One Health 至关重要，但这需要深入理解复杂微生物环境中 MDR 菌株与质粒涌现的机制。作者亦坦承移动 AMR 实验室的局限性：便携 qPCR 与纳米孔测序仪器相对昂贵、培养工作仍依赖传统琼脂平板、生物信息学分析未能在现场完成等。未来可通过 Redigel 系统、Sensititre MIC 系统、便携式 GPU 加速现场分析、纳米孔碱基修饰检测与适应性测序等手段进一步优化。

最终，这项研究为加拉帕戈斯群岛的 AMR 风险评估与污水基础设施现代化升级提供了直接的科学支撑，证明了移动微生物学实验室作为全球 AMR 监测模型在指导政策、公共工程与临床决策方面的强大潜力。

参考文献

1. Lal, A., Riopelle, J. C., Villarin, K., et al. (2026). Human wastewater contamination drives the emergence of multidrug-resistant bacteria in the Galápagos marine ecosystem.Nature Communications, 17, 7601. https://doi.org/10.1038/s41467-026-74899-9

2. 现场 AMR 实验室标准操作流程：https://protocols.hostmicrobe.org/field-amr-sops

3. 数据分析代码仓库：https://github.com/ruicatxiao/GERA

4. 宏基因组测序数据：Sequence Read Archive 登录号 PRJNA1320681

5. 大肠杆菌分离株全基因组测序数据：Sequence Read Archive 登录号 PRJNA1320685

6. 加拉帕戈斯国家公园 2024 年关于圣克里斯托瓦尔岛海滩污染的制裁程序公告：https://galapagos.gob.ec/comunicado-oficial-2/